重组幽门螺杆菌多表位疫苗工程菌株的构建及其微生物学特性研究

目的 构建含有幽门螺杆菌尿素酶（\ureI、ureB）及霍乱毒素B亚单位（\ctB）融合片段的多表位疫苗工程菌,并研究其微生物学特性。方法 通过生物信息学方法从\ureI、ureB基因中筛选出T细胞和B细胞优势表位,通过柔性Linker相连,并在其N端加入分子内佐剂序列\ctB,按照大肠杆菌BL21(DE3)的密码子偏好性进行密码子优化,即为BIB序列。人工合成之后,插入原核表达质粒pET28a(+)中,构建pET28a(+)/\ctB-ureI-ureB〔pET28a(+)/BIB〕重组质粒。经限制性内切酶酶切鉴定及DNA测序鉴定正确后,将质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。BIB工程菌经乳糖诱导表达后,SDS-PAGE检测重组蛋白BIB的表达情况,并对其N端氨基酸序列和相对分子质量进行测定,Western blot对其进行抗原性鉴定。结果 原核表达质粒pET28a(+)/BIB经双酶切和测序鉴定构建正确,SDS-PAGE电泳显示在相对分子质量33×10^\3处有一条明显条带,其N端氨基酸序列和相对分子质量与设计序列100%一致,Western blot结果显示BIB可以与抗幽门螺杆菌悉尼株（SS1株）小鼠血清及鼠抗CTB单抗产生特异性反应。结论 成功构建了幽门螺杆菌多表位重组原核表达工程菌,该工程菌表达的BIB蛋白抗原性良好。     

头孢吡肟对医院分离的革兰阴性杆菌的体外抗菌活性的四种方法学评价

目的词查四川大学华西医院2004年9月～11月301株临床常见革兰阴性杆菌对第四代头孢菌素头孢吡肟的耐药状况，评价我院现采用的MICROSCAN细菌鉴定药敏系统中快速接种法的准确性。方法用琼脂稀释法、纸片扩散法、标准浊度法和MICROSCAN快速接种法测定头孢毗肟对301株细菌的体外抑菌活性。以琼脂稀释法为标准参考方法，比较其它三种方法与其一致性。结果琼脂稀释法测定301株革兰阴性杆菌对头孢吡肟的体外总敏感率为78．1％；纸片扩散法、标准浊度法和MICROSCAN快速接种法与标准参考方法的一致率分别为：99．00%、98．3％和95．3％。纸片扩散法、标准浊度法与琼脂稀释法无统计学差异，MICROSCAN快速接种法与琼脂稀释法有统计学差异。结论头孢吡肟对大部分临床常见革兰阴性杆菌具有良好的体外抗菌活性。纸片扩散法及标准浊度法结果准确性较高。我院现采用的MICROSCAN快速接种法的准确性有待进一步探讨。     

感染性疾病疫苗佐剂的研究进展

新型疫苗 ,尤其是重组蛋白和DNA疫苗比传统疫苗更优越 ,但其免疫原性减弱 ,急需发展新的或改进的疫苗佐剂。佐剂对一些感染性疾病的疫苗研究及应用非常重要。根据佐剂的作用机制 ,可把佐剂分为免疫刺激性佐剂和疫苗传送系统两大类。免疫应答机制的进一步研究将会促进疫苗佐剂的研究发展。     

15902例门诊患者人乳头瘤病毒亚型感染情况分析

目的分析门诊患者人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)亚型感染情况,为宫颈疾病的防治提出依据。方法收集2013~2015年四川省妇幼保健院宫颈门诊15 902例患者HPV检测及病理诊断结果,统计分析门诊患者HPV感染情况、阳性患者宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)≥Ⅱ级患病情况、21种基因型的分布情况及其在≥CINⅡ患者中分布情况。结果 2013~2015年,检测基数逐年增加,HPV感染率逐年增高,且有递增趋势(P0.05),但≥CINⅡ构成比逐年降低,且有递减的趋势(P0.05);所有患者中,主要感染亚型为HPV 52、16、58、53、18;在≥CINⅡ患者中,主要感染亚型为16、58、52、33、18,与总体感染亚型分布有一定差异。结论 2013~2015年,我院宫颈门诊HPV感染率增高,≥CINⅡ构成比低,感染亚型及其致病性存在地区性。     

干扰乳酸脱氢酶A表达对ErbB2高表达乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响

目的 探讨体外干扰乳酸脱氢酶A（LDHA）表达对人类表皮生长因子受体2（ErbB2）高表达乳腺癌SK-BR-3和MDA-MB-453细胞迁移和侵袭的影响及其分子机制。方法 用siLDHA转染（以转染scramble siRNA为阴性对照）SK-BR-3和MDA-MB-453细胞干扰LDHA的表达;Western blot法检测LDHA蛋白表达水平;Transwell小室检测细胞的迁移和侵袭能力;采用乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒测定细胞的LDH活性;采用葡萄糖和乳酸检测试剂盒分别测定培养基中的葡萄糖浓度和乳酸浓度,计算细胞对葡萄糖的摄取量和乳酸生成量。结果 与阴性对照组比较,siLDHA下调SK-BR-3和MDA-MB-453细胞LDHA的蛋白水平（ P<0.01）;降低细胞的迁移和侵袭能力（ P<0.001）;下调SK-BR-3细胞的LDH活性,减少两种细胞葡萄糖摄取量和乳酸生成量,差异均有统计学意义（ P<0.05）。结论 干扰LDHA表达通过降低糖酵解从而抑制ErbB2高表达乳腺癌细胞的迁移和侵袭。     

四种幽门螺杆菌检测方法的灵敏度比较实验

  目的  用标准微生物学方法测定4种幽门螺杆菌实验室常用检测方法的灵敏度并纵向比较各方法的差异性。  方法  用幽门螺杆菌标准菌株（SS1）为参照,以菌落形成单位（CFU）为测定能力定量分析单位,以不同浓度梯度稀释的SS1菌液为模拟样本,分别对幽门螺杆菌培养法、快速脲酶试验法、抗原检测法、荧光定量PCR法进行测定能力的试验研究,记录4种幽门螺杆菌常用检测方法对应的不同浓度的CFU值并进行差异性分析。  结果  幽门螺杆菌培养法检测灵敏度为2.0×10 CFU/mL,快速脲酶试验法检测灵敏度为2.0×107 CFU/mL,抗原检测法检测灵敏度为2.0×105 CFU/mL,荧光定量PCR法检测灵敏度为2.0×102 CFU/mL。  结论  幽门螺杆菌实验室不同检测方法的灵敏度差异显著。培养法和荧光定量PCR法的敏感性较高,但培养法耗时长、操作复杂;抗原检测和快速脲酶试验需要的时间短,但试验敏感性较低。临床以及实验室可根据检测目的选择能识别幽门螺杆菌对应变化的检测方法。     

HCV体外复制细胞模型的建立

目的 建立HCV体外复制细胞模型。方法 用含有生长HCV基因的p90／HCVFL-longp U质粒，转化Sure细胞，36℃摇菌18h，提取质粒，以线性化DNA为模板，用T7RNA体外转录系统作体外转录，转录产物RNA作RT-PCR、普通琼脂糖凝胶电泳鉴定。采用lipofectin包裹HCVRNA转染生长良好的HepG2细胞。转染48h后收集细胞，TRIzol提取RNA，分别用正链及负链引物作RT-PCR，确定转染细胞中有无HCV的复制中间体及病毒核酸。作免疫组化确定有无病毒NS3、NS5抗原。结果 体外可获得高浓度全长HCV-RNA，但转染未获成功。结论 全长HCV-RNA转染细胞模型的建立尚需进一步研究。     

幽门螺杆菌多靶点疫苗工程菌BIB发酵及纯化工艺研究

目的初步建立重组幽门螺杆菌多靶点疫苗工程菌（BIB）的高密度发酵及其蛋白纯化工艺。方法以摇瓶发酵结果为基础,放大工艺至50L发酵罐中,对影响目的蛋白收率的因素如发酵培养基、工作种子接种量、诱导剂浓度、诱导起始时间、诱导持续时间及诱导剂添加方式等进行优化验证;并利用rBIB蛋白高等电点特性（pI=9.05）,在pH 7.0-7.5的磷酸盐缓冲液中目的蛋白带正电荷,采用阳离子交换层析进行纯化,对阳离子交换层析填料及纯化缓冲液的pH进行优化。结果经高密度发酵后BIB菌体产量为70g/L,蛋白表达量为32%;rBIB蛋白经阳离子交换层析纯化后其纯度为91.8%。结论该工艺的初步建立为深入研究rBIB蛋白性质及其规模化生产奠定了基础。     

EAE小鼠模型的构建及其免疫学机制的探讨

目的 用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(MOG35-55) 多肽免疫C57BL/6小鼠建立实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型并初步探讨EAE发病的免疫学机制.方法 用MOG35-55抗原免疫C57BL/6小鼠,观察实验动物的症状及中枢神经系统的病理改变;应用MTT法测定EAE 小鼠脾脏T淋巴细胞活化增殖程度;应用ELISA技术测定EAE小鼠血清IFN-γ浓度和抗MOG 35-55抗体水平.结果 EAE组发病率为100%,HE染色观察到脑脊髓炎性细胞浸润,白质脱髓鞘等病理改变;EAE小鼠脾脏MOG35-55反应性T淋巴细胞增殖活化,血清IFN-γ浓度和抗MOG35-55抗体随病情的加重而升高.结论 用MOG35-55多肽成功诱导了C57BL/6小鼠EAE模型;并推断EAE的发生可能与MOG 35-55反应性T淋巴细胞的活化、抗MOG35-55抗体和IFN-γ升高有关.     

流感病毒多表位核酸疫苗CTB-Eg的构建与细胞转染研究

目的设计并构建含分子内佐剂的流感病毒多表位核酸疫苗CTB-Eg,初步研究其在HEK293T细胞中的转染效率。方法通过生物信息学软件设计并合成了含分子内佐剂的流感病毒多表位基因CTB-Eg,将其插入真核载体pEGFP-C2中,获得了重组质粒pEGFP-C2/CTB-Eg;用脂质体法转染HEK293T细胞,通过荧光显微镜观察和PCR法检测其转染效率。结果成功构建了真核表达质粒pEGFP-C2/CTB-Eg,且该重组质粒能在HEK293T细胞中瞬时转染,转染效率在50%~70%之间。结论本研究成功设计、构建了CTB-Eg融合基因,其在HEK293T细胞中转染效率较高,为流感病毒多表位核酸疫苗CTB-Eg在小鼠体内的抗病毒作用研究奠定了坚实基础。